Tyra Berge Aspenes,a,b, Elisabeth Leere Øiestada,b, Frederik André Hansen,a, Åse Marit Leere Øiestad,c,
Marianne
Skov-Skov Bergh,b
a Universitetet i Oslo, Farmasøytisk Institutt, Seksjon for legemiddelanalyse, Postboks 1068 Blindern, 0316 Oslo
b Oslo Universitetssykehus, Avdeling for rettsmedisinske fag, Seksjon for rusmiddelforskning, Postboks 4950
Nydalen, 0424 Oslo
c Oslo Universitetssykehus, Avdeling for rettsmedisinske fag, Seksjon for rettstoksikologisk analytikk, Postboks
4950 Nydalen, 0424 Oslo
Email: tyrasp@ous-hf.no / tyraba@student.farmasi.uio.no
Analyse av nivåer og endringer i nevrotransmittere i hjernen er viktig for å forstå hvordan den påvirkes av rusmidler [1]. Dagens metoder for prøveopparbeidelse av hjernevev til analyser er tidkrevende. En annen utfordring med analyse av nevrotransmittere er at de er svært polare, og har kort retensjonstid ved omvendt fase kromatografi [2]. For å løse disse utfordringene og samtidig oppnå selektiv ekstraksjon, vurderes elektromembranekstraksjon (EME) som et alternativ til tidkrevende prøveopparbeidelse.
EME er en mikroekstraksjonsmetode introdusert for første gang i 2006 [3]. Metoden består av en donor- og akseptorløsning, adskilt av en supported liquid membrane (SLM). Donorløsningen er typisk en kompleks biologisk matriks, og akseptorløsningen er vandig. Analyttene i donorløsningen blir selektivt ekstrahert over membranen ved hjelp av retningen på det elektriske feltet, pH og derav analyttenes ladning, og den organiske løsningen immobilisert på membranen [4]. Etter ekstraksjonen kan den rene vandige akseptorløsningen analyseres med LC-MS/MS.
For å utvikle LC-MS/MS-metoden ble åtte nevrotransmittere, acetylkolin, adrenalin, dopamin, GABA, glutamin, glutaminsyre, noradrenalin og serotonin, og to metabolitter, 3-MT og 5-HIAA, tillaget i 25 mM maursyre. Innledende forsøk med sur mobilfase, 25 mM maursyre/metanol, og to forskjellige kolonner, HSS-T3 (Waters) og Kinetix biphenyl (Phenomenex), med både lineær gradienteluering og isokratisk eluering over 10 minutter, ga svært begrenset retensjon. I en tidligere utviklet metode ble ioneparringsreagenset heptafluorobutyric acid (HFBA) brukt til å øke retensjonstiden av adrenalin og noradrenalin [5]. HFBA ble derfor tilsatt mobilfasen for begge kolonner. HSS-T3-kolonnen ga god separasjon av nevrotransmitterne og økte retensjonstiden tilstrekkelig.
Innledende forsøk med EME indikerer at bis(2-ethylhexyl) phosphate (DEHP) i konsentrasjoner mellom 1-50% i kombinasjon med en eutektisk blanding av 6-methylcoumarin:thymol 1:2 er en egnet SLM. Videre er McIlvaine-buffer med 5% (w/v) ascorbic acid (AA) med pH-verdier fra 2,5 til 6,5 testet, samt ulike akseptorløsninger. Foreløpige resultater tyder på at pH bør ligge et sted mellom 2,5-3,5. Videre optimalisering skal utføres før metoden valideres etter gjeldende retningslinjer.
Figur: Kromatogram med optimalisert gradient og akseptor-plot for pH = 2,5-4,5 og %DEHP = 1-10%
Referanser
[1] Oslo Universitetssykehus, «Experimental Drug Abuse Research». Hentet fra: OUH – Neurobiology (lastet ned: 14.11.2025)
[2] M. S.-S. Bergh, I. L. Bogen, E. Lundanes og Å. M. L. Øiestad, «Validated methods for determination of neurotransmitters and metabolites in rodent brain tissue and extracellular fluid by reversed phase UHPLC-MS/MS», Journal of Chromatography B, 1028 (2016) 120-129
[3] S. Pedersen-Bjergaard og K. E. Rasmussen, «Electrokinetic migration across artificial liquid membranes. New concept for rapid sample preparation of biological fluids», Journal of Chromatography A, 1109 (2006) 183-190
[4] M. Schüller, F. A. Hansen, T. G. Skaalvik og S. Pedersen-Bjergaard, «Conductive vial electromembrane extraction – Principles and practical operation», Analytical Science Advances, 2023;4:236-243
[5] M. S.-S. Bergh, I. L. Bogen, J. M. Andersen, Å. M. L. Øiestad og T. Berg, «Determination of adrenaline, noradrenaline and cortisone in rodent blood by ion pair reversed phase UHPLC-MS/MS», Journal of Chromatography B, 1072 (2018) 161-172